Di Laurent BERLIET e Silvia RIZZI di Mesa Labs France
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Quando si sterilizza un prodotto liquido acquoso a vapore, generalmente si convalida la sua sterilizzazione utilizzando un indicatore biologico (BI) commerciale liquido ad immersione conforme alla ISO 11138-3, sospeso nella posizione più fredda della massa liquida (Spore News Vol-7 No-5), che indica se le specifiche condizioni di sterilizzazione siano state correttamente raggiunte. Indicatori biologici (BI) come le MagnaAmp o SterilAmp sono costituiti da un'ampolla di vetro sigillata, con spore di Geobacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis 5230 inoculate in un terreno di coltura con un indicatore colorato di pH che cambierà colore se le spore sopravvivono. Questi BI hanno un resistenza nota, come descritto nelle norme, misurata in un resistometro (ISO 18472) e definita dal valore D e da una popolazione che caratterizzano ciascun lotto fabbricato.
A seconda della sensibilità al calore del prodotto liquido da trattare, ci sono due approcci comuni utilizzati, il metodo Overkill e il metodo Bioburden / Indicatore Biologico. Il metodo Overkill è il metodo più diffuso (ed il più semplice da applicare) quando gli articoli da sterilizzare possono resistere ad un'esposizione prolungata al processo di sterilizzazione. Tale metodo può essere convalidato utilizzando un BI conforme alla ISO 11138 con un valore D121 ≥ 1,5 min e una popolazione ≥ 105 ; tuttavia una popolazione superiore a 106 è più comunemente usata e raccomandata. Questo metodo consente di inattivare BI con un'alta concentrazione di organismi molto resistenti e non richiede monitoraggio e controllo costanti della carica microbica (bioburden).
Per prodotti sensibili al calore e con cicli con F0 basso, è preferibile il metodo Bioburden/BI con la possibilità di utilizzare un indicatore biologico sotto forma di fiala ad immersione (BI), inoculato con una popolazione inferiore (ad esempio 104 ) di G. stearothermophilus o un altro ceppo come B. subtilis 5230 (un organismo meno resistente).
In questa SporeNews, parleremo di prodotti non sensibili al calore sterilizzati con il metodo Overkill, mentre i prodotti sensibili al calore e il metodo BI/Bioburden saranno discussi nella prossima SporeNews (parte 2). Questi diversi metodi di convalida sono trattati nella ISO 11138-7, nella Farmacopea americana (USP) e nella Farmacopea europea (EP).
Perché effettuare uno studio del valore D a contatto diretto con il prodotto quando utilizziamo un BI conforme allo standard ISO 11138-3 per un ciclo Overkill?
Come sottolineato nelle recenti versioni dell'USP e dell'EP, le proprietà del materiale sterilizzato possono influenzare significativamente la resistenza/letalità dei microrganismi, specialmente per i prodotti liquidi.
USP 40 1229.2 Moist Heat Sterilization of Aqueous Liquids
“BIOLOGICAL INDICATORS
The selection of a BI must be considered carefully because of the balance that must be maintained between attaining sterilization and maintaining the sterilized material’s essential quality attributes. The biological challenge is either directly inoculated into a liquid-filled container or is introduced via self-contained units provided there is adequate correlation between their resistance and the resistance that would occur in the process fluid. The liquid can be either the product or a surrogate fluid. The resistance of the indicator in the product (and surrogate fluid, where used) must be known. The surrogate’s physical properties should approximate those of the product. If there are surfaces within the container that are not presterilized, biological challenge of those surfaces may be required.
LIQUID D-VALUE DETERMINATION
Determination of the thermal resistance (D-value and z-value) for the biological indicator in the liquid is required. This must be performed in a Biological Indicator Evaluation Resistometer (BIER) in replicate. The thermal resistance of each BI lot in the liquid should be determined. When a surrogate liquid is used for convenience (e.g., a master solution approach) or because of microbial inhibition of the BI by the liquid, the thermal resistance in the surrogate must be determined.”
European Pharmacopoeia 9.2 :2017
5.1.2.2 “Spores inoculated into a product or onto surfaces are known to react differently to sterilizing conditions as compared to biological indicator units. In these cases, commercially available biological indicator units may not be suitable to test sterilization effectiveness and an inoculated test product/item prepared from a well-characterized spore suspension may be a better model to evaluate the effectiveness of the sterilization cycle.”
Poiché la resistenza di un BI vapore standard è misurata su G. stearothermophilus inoculato in un terreno di coltura con indicatore colorato di pH contenuto in un'ampolla di dimensioni variabili, la domanda da porsi è: quale sarebbe il valore D se le spore di G. stearothermophilus fossero state inoculate direttamente nel prodotto? Il valore D delle spore a diretto contatto con il prodotto sarebbe inferiore o superiore al valore D indicato sul certificato di analisi del BI standard?
Il valore D121 per i BI liquidi in fiale è generalmente compreso tra 1,5 e 2,5 min. Lo scopo di questa analisi del valore D a contatto con il prodotto sterilizzato è valutare l'impatto del prodotto sui microrganismi per garantire che il BI utilizzato per convalidare il ciclo rappresenti una sfida sufficiente a garantire un livello di assicurazione sterilità (SAL) adeguato sul prodotto sterilizzato. Questo studio preliminare permette altresi di determinare il più accuratamente possibile il ciclo da applicare per ottenere un SAL di 10-6 e quindi di rivendicare e garantire la sterilità del proprio prodotto. È essenziale eseguire questo studio in fase di sviluppo prodotto. Per i cicli esistenti, uno studio del valore D nel prodotto consentirà di confermare la scelta storicamente realizzata e soprattutto conformarsi alle norme vigenti.
Iniziamo, ad esempio, considerando un prodotto liquido, filtrabile non termosensibile, sterilizzabile con approccio Overkill. Per eseguire lo studio, una serie di fiale di vetro (o dispositivi preriempiti) contenenti il prodotto da analizzare vengono inoculate con una popolazione 106 di spore di G. stearothermophilus per fiala e sigillate.
Per confrontare il valore D ottenuto nel prodotto liquido con il valore D di un BI standard in fiala, si raccomanda di selezionare una coltura di spore utilizzata per produrre questi stessi BI e di eseguire il test con gli stessi parametri e con la stessa attrezzatura utilizzata per testare questi BI standard. In alcuni casi, per piccoli volumi (siringhe preriempite, fiale), lo studio può essere condotto sull’intero dispositivo compreso il contenitore.
Rivolgersi al produttore dei BI che verranno utilizzati in fase di convalida per l’esecuzione di questi studi, permetterà un confronto ottimale. Qualora non fosse possibile, il laboratorio terzista dovrà tassativamente eseguire un confronto in parallelo nelle sue condizioni con il BI che verrà utilizzato in convalida, al fine di ottenere risultati comparabili.
I nostri laboratori MesaLabs hanno maturato una consolidata esperienza negli anni specializzandosi nell’esecuzione di studi di D-value su prodotti liquidi farmaceutici, tappi, e persino dispositivi completi (come siringhe preriempite) per integrare tutti i vincoli legati alla sterilizzazione. Tutte le nostre procedure sono conformi alle norme USP/ISO e realizzate in un laboratorio certificato ISO 13485, attrezzato con diverse apparecchiature di test conformi all’ ISO 17472.
La maggior parte di questi prodotti acquosi ha una composizione o una consistenza che non verrà modificata durante il ciclo, quindi una cinetica di letalità lineare è generalmente ottenuta allo stesso modo di un BI standard (ISO 11138-1 con r2 > 0,8). Quando viene analizzato il valore D di un prodotto farmaceutico, si riscontrano due tipi di scenari.
Il valore D misurato nel prodotto è inferiore o uguale al valore D del BI liquido standard (non significativamente diverso). In questo caso, il BI standard rappresenta effettivamente una sfida worst case e può essere utilizzato per qualifiche e convalide periodiche: vedere il grafico 1.
In questo esempio, G. stearothermophilus inoculato nel prodotto ha un valore D121 di 1 minuto; pertanto, l'utilizzo di un BI con valore D compreso tra 1,5-2,5 minuti è una scelta appropriata.
Qualora il valore D misurato nel prodotto fosse superiore al valore D del BI liquido standard (> 2,5 o 3min), sarà difficile trovare un BI con resistenza equivalente o maggiore. In questo caso, il BI non rappresenta più il caso peggiore (si veda il grafico 2).
In tal caso, la soluzione più appropriata consiste nel validare il ciclo mediante inoculo diretto del prodotto con spore di G. stearothermophilus. L'inoculo può essere effettuato a partire da una sospensione di spore con una popolazione di 106 o 107 / 0,1 ml, tuttavia é richiesta la convalida del metodo per garantire l'omogeneità dell'inoculo nel prodotto.
Ciò può generare difficoltà in termini di fattibilità, certificazione, stabilità, recupero delle spore.
Quando non è possibile validare il metodo di inoculo con una sospensione di spore, è possibile inoculare le spore introducendo un BI strip cartaceo nudo direttamente nel liquido. Ciò garantirà la popolazione attesa e certificata.
Un metodo alternativo potrebbe essere preso in considerazione qualora la carica microbica (bioburden) sia costantemente monitorata.
Se la carica microbica è inferiore a 102 CFU ad esempio, con 8 SLR (riduzioni logaritmiche di spore) si può rivendicare un SAL di 10-6. In questo caso e in teoria, un BI standard con G. stearothermophilus 106 può essere utilizzato per convalidare la distruzione equivalente a 8 SLR su G. Stearothermophilus avente una resistenza superiore a diretto contatto con il prodotto (si veda il grafico 3). Questo metodo bilancia la resistenza inferiore del BI standard con una popolazione maggiore del BI rispetto alla carica microbica reale.
Per applicare questo confronto il divario di resistenza BI/prodotto non deve essere troppo elevato (<50%). L’alternativa proposta, basandosi su una correlazione matematica, potrebbe non essere accettata da alcuni ispettori o autorità in quanto va oltre il quadro definito dai metodi di convalida.
Nella prossima Spore News, avremo l'opportunità di discutere altri casi di studio come prodotti termosensibili e prodotti liquidi acquosi atipici.